Práctica 12: Técnica de Ficoll

Objetivo

Obtener leucocitos a partir de sangre total mediante la técnica de Ficoll.

Fundamento

La técnica más habitual para obtener preparaciones de linfocitos de sangre periférica purificadas o enriquecidas, necesarias para realizar pruebas in vitro, es la separación de linfocitos por centrifugación en gradiente de Ficoll.

La sangre total desfibrinada se diluye en medio de cultivo y se vierte sobre un tubo lleno hasta la mitad de un medio con Ficoll. Seguidamente se centrifuga y se consigue la separación de los linfocitos.

Aunque esta técnica separa los leucocitos mononucleares, incluyendo tanto linfocitos como monocitos, cuando las muestras proceden de sangre periférica, son mucho más abundantes los linfocitos.

Fuente: Cuéllar del Hoyo, Carmen. Gómez Barrio, Alicia (2016). Técnicas de Inmunodiagnóstico. Editorial Altamar. ISBN: 8416415269

Materiales y reactivos

Sangre con EDTA, SSF, 2 tubos de 10mL estériles, micropipeta 1000μL, Ficoll, centrífuga, pipeta pasteur, tubo eppendorf, portaobjetos, portaobjetos esmerilado, tinción panópitico, microscopio.

Procedimiento

1.- Extraer la sangre.

2.- Diluir 2mL de sangre con 2mL de SSF.

3.- Depositar 3mL de Ficoll en un tubo y 4mL de la dilución anterior, evitando que se mezclen.

4.- Centrifugar a 1800 x g durante 25min.

5.- Recoger la fracción entre el plasma y el Ficoll (leucocitos) con una pipeta pasteur y verter en un eppendorf.

6.- Realizar una extensión de dichos leucocitos.

7.- Realizar una tinción de panóptico rápido.

8.- Observar la tinción al microscopio.

Resultados
-Los granulocitos, más densos que el medio de separación, pasan a través de él y quedan depositados en el fondo del tubo.

-Los eritrocitos se aglutinan en contacto con el Ficoll,y los aglutinados se depositan en el fondo del tubo.

-Las células mononucleares (linfocitos y monocitos) se quedan en la interfase entre el plasma y el medio de separación, debido a que tienen una densidad menor.